Quyết định số 3351/2001/QĐ-BYT ngày 31/07/2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế Về Thường quy kỹ thuật định lượng Streptococcus faecalis trong thực phẩm” (Văn bản hết hiệu lực)

QUYẾT ĐỊNH

VỀ VIỆC BAN HÀNH “THƯỜNG QUY KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG STREPTOCOCCUS FAECALIS TRONG THỰC PHẨM”

BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ

Căn cứ theo Nghị định số 68/CP ngày 11/10/1993 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và tổ chức bộ máy của Bộ Y tế;
Căn cứ theo Nghị định số 86/CP ngày 08/12/1995 của Chính phủ về việc phân công trách nhiệm quản lý nhà nước đối với chất lượng hàng hóa;
Căn cứ theo Quyết định số 14/1999/QĐ-TTg ngày 04/02/1999 của Thủ tướng Chính phủ về việc thành lập Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm;
Theo đề nghị của Chánh văn phòng, Vụ trưởng Vụ Khoa học Đào tạo, Vụ trưởng Vụ Pháp chế, Chánh thanh tra – Bộ Y tế và Cục trưởng cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm,

QUYẾT ĐỊNH

Điều 1. Ban hành kèm theo Quyết định này “Thường quy kỹ thuật định lượng Streptococcus faecalis trong thực phẩm”.

Điều 2. Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày ký ban hành.

Điều 3. Các ông, bà: Chánh văn phòng, Chánh thanh tra, Vụ trưởng các Vụ: Khoa học Đào tạo, Pháp chế, Y tế dự phòng – Bộ Y tế; Cục trưởng Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, Giám đốc Sở Y tế các Tỉnh, Thành phố trực thuộc Trung ương và Thủ trưởng các đơn vị trực thuộc Bộ Y tế chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này.

THƯỜNG QUY KỸ THUẬT

ĐỊNH LƯỢNG STREPTOCOCCUS FAECALIS TRONG THỰC PHẨM

(Ban hành kèm theo Quyết định số 3351/QĐ-BYT ngày 31 tháng 7 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế)

I. NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP

Streptococcus faecalis (S. faecalis) (Liên cầu phân) phát triển được trong môi trường  có Natri azit 0,04% tạo thành các khuẩn lạc màu đỏ hoặc nâu đỏ. Lựa chọn khẩu lạc điển hình, xác định tính chất sinh vật hóa học theo thường quy.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Áp dụng cho việc phát hiện ô nhiễm S.faecalis trong sản phẩm thực phẩm

III. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ

1. Dụng cụ, thiết bị

Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật.

2. Môi trường, thuốc thử

- Canh thang natri azit.

- Thạch TTC natri azit (Thạch Slanetz và Bartley).

- Canh thang azit etyl màu tía.

- Các môi trường hóa chất thông dụng.

IV. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ

1. Chuẩn bị môi trường

Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hóa học được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110^OC/30 phút hoặc 121^OC/15 phút). (Phụ lục kèm theo)

2. Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử

2.1. Chuẩn bị mẫu

Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.

2.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10^-1

- Cân hoặc hút chính xác 50g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc 50ml thực phẩm lỏng), cho vào bình nón chứa sẵn 450ml nước đệm muối 3%.

- Lắc đều 2 – 3 phút. Thu được dung dịch mẫu thử 10^-1

2.3. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10^-2, 10^-3, 10^-4...

- Hút chính xác 50ml dung dịch mẫu thử 10^-1 cho sang bình nón chứa sẵn 450ml nước đệm muối 3%.

- Lắc đều trong 2 - 3 phút. Thu được dung dịch 10^-2.

- Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10^-3, 10^-4, 10^-5... (theo sơ đồ)

3. Các bước xét nghiệm

3.1. Xét nghiệm định tính

a) Tăng sinh

Cho 10ml (Hoặc 50; 100 ml) dung dịch thực phẩm đồng nhất 1:10 vào bình canh thang natri azit đặc theo tỷ lệ 1:1, ủ ẩm 37^OC/72 giờ. S.faecalis phát triển làm đục môi trường và chuyển màu môi trường từ tím sang vàng.

b) Hình thể và tính chất bắt mầu

- Từ ống canh thang có mọc vi khuẩn, cấy chuyển sang đĩa thạch TTC natri azit, ủ ấm 37^OC/18-24 giờ. Khuẩn lạc S.faecalis điển hình: nhỏ, lồi, bờ đều, có màu đỏ hoặc nâu đỏ.

- Trích biệt khẩu lạc làm tiêu bản nhuộm Gram: Vi khuẩn hình cầu, xếp thành chuỗi, bắt mầu thuốc nhuộm Gram, Gr (+).

3.2. Định lượng

a) Phương pháp MPN

- Cấy 50ml dung dịch mẫu thử 10^-1 vào bình 50ml canh thang Natri azit đặc.

- Cấy 5 ống, mỗi ống 10ml dùng dịch mẫu thử 10^-1 vào ống 10ml cạnh thang Natri azit đặc.

- Cấy 5 ống, mỗi ống 1ml dùng dịch mẫu thử 10^-1 vào ống canh thang Natri azit

- Cấy 5 ống, mỗi ống 1ml dung dịch mẫu thử 10^-2 vào ống canh thang Natri azit.

- Tiếp tục như vậy với dãy sau có đậm độ pha loãng thấp hơn 10 lần so với dẫy trước nếu đậm độ vi khuẩn quá nhiều.

- Ủ ấm 37⁰C, trong 3 ngày (72 giờ). S.faecalis phát triển làm đục môi trường và chuyển mầu môi trường từ đỏ tía sang vàng.

* Xác định hình thể và tính chất bắt mầu.

- Đánh dấu các ống dương tính, cấy chuyển sang ống canh thang azit etyl màu tía, ủ ở nhiệt độ 44-45^OC/24 giờ hoặc sang đĩa thạch TTC natri azit, ủ ấm
37⁰C/18-24 giờ.

- Trích biệt khuẩn lạc điển hình làm tiêu bản nhuộm Gram

* Đọc kết quả:

- Nếu ở đáy ống xuất hiện màu đỏ tía và môi trường trở nên đục thì kết luận dương tính.

- Tra bảng MPN ở nồng độ tương ứng, tính số vi khuẩn/g

Ví dụ:               

Nồng độ 10^-1: có 3 ống (+);

Nồng độ 10^-2: có 1 ống (+);

Nồng độ 10^-3: có 0 ống (+);

Tra bảng MPN, xác định trong 1g mẫu thử có 43 con vi khuẩn

b) Phương  pháp cấy đếm trên đĩa thạch

* Cấy trên môi trường đặc:

- Phương pháp này sử dụng môi trường thạch TTC natri azit, tiến hành giống như cấy đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí.

- Ủ ấm 37^OC/24 giờ.

- Khuẩn lạc điển hình: Lồi, nhỏ, bờ đều, mặt nhẵn, màu đỏ hoặc nâu đỏ.

- Trích biệt khuẩn lạc điển hình, nhuộm Gram để xác định hình thể và tính chất bắt mầu.

- Từ khuẩn lạc điển hình, cấy chuyển sang canh thang azit etyl, ủ ấm 44 - 45^OC/24 giờ. S. faecalis phát triển làm đục đều môi trường và chuyển mầu môi trường sang đỏ.

* Đọc kết quả

Số lượng S.faecalis có trong 1g thực phẩm được biểu thị bằng trung bình cộng tổng số khuẩn lạc có trên đĩa thạch ở cùng nồng độ pha loãng, nhân với hệ số pha loãng.

Ví dụ: Độ pha loãng 10^-2:           

- Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 1 có: 10 khuẩn lạc

- Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 2 có: 14 khuẩn lạc

- Số khuẩn lạc có trong 1g thực phẩm được tính

Như vậy: trong 1g thực phẩm có 1,2 ´ 10² vi khuẩn S.faecalis

3. Phương pháp màng lọc (dùng cho thực phẩm dạng lỏng có thể thấm qua màng lọc)

Lọc 100ml dùng dịch thực phẩm, sau đó đặt màng lọc lên trên đĩa thạch TTC natri azit rồi tiến hành như đếm trên đĩa.

Sơ đồ định lượng S. faecalis

PHỤ LỤC

MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THƯỜNG DÙNG ĐỂ XÉT NGHIỆM S.faecalis

1. Canh thang Natri azit

Pepton                                      20,0g

Đường glucoza                          15,0g

Natri chlorua (NaCl)                    5,0g

K₂HPO₄                                     2,7g

Natri azit                                   0,4g

Bromocresol màu tía                  0,015g

Nước cất                                  1000ml

Cách pha:

- Cho tất cả (trừ natri azit) vào nồi rồi đun cho tan, lọc, chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt trùng là 7,2. Hấp 121^OC/15 phút.

- Natri azit: Pha trong nước cất cho tan (thường pha ở tỷ lệ 1%), lọc vô khuẩn, đóng vào bình tối màu để bảo quản ở 4^OC. Cho vào canh thang đã hấp và để nguội (khoảng 50^OC) tùy theo thể tích để đạt nồng độ cuối cùng là 0,04%.

- Canh thang đặc cũng được pha như trên nhưng tất cả các chất đều có khối lượng gấp đôi (trừ nước).

2. Thạch TTC Natri azit (Thạch Slanetz & Bartley)

Pepton                                                  20,0g

Cao nấm men                                        5,0g

Đường glucoza                                      2,0g

K₂HPO₄                                                 4,0g

Natri azit                                               0,4g

Triphenyltetrazoiumchlorit (TTC) 0,1g

Agar                                                     15,0g

Nước cất                                              1000ml

pH                                                        7,2

Cách pha

- Cho tất cả các chất (trừ natri azit và TTC) vào nồi rồi đun sôi cho tan, lọc, chỉnh pH và hấp tiệt trùng 121^OC/15 phút. Để nguội khoảng 50^OC. Cho dung dịch natri azit và TTC vào để đạt nồng độ tương ứng là 0,04% và 0,01%.

- Pha TTC như pha natri azit ở trên.

3. Canh thang azit etyl màu tía

Pepton                                      20,0g

Đường glucoza                          15,0g

Natri chlorua (NaCl)                    5,0g

K₂HPO₄                                     2,7g

Natri azit                                   0,4g

Azit etyl màu tía                        0,00083g

Nước cất                                  1000ml

Cách pha: Như pha canh thang natri azit

4, Nước pepton 0,1%

Pepton                                      1,0g

Nước cất                                  1000ml

* Chỉnh pH = 7,2

Sơ đồ định lượng P. aeruginosa

a) Xác định nồng độ formaldehyd ban đầu:

b) Pha dung dịch formaldehyd nồng độ 10 ppm:

10 x ppm     (1000 x ppm)   10^-1                             10^-1                                      10^-2

UV - VIS  đông lại đem

- Quinolin                      Qui nolin

Sơ đồ định lượng          Sơ đồ định lượng          Sơ đồ định lượng

Sơ đồ định lượng B.cereus trong thực phẩm