Quyết định số 3347/2001/QĐ-BYT ngày 31/07/2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế Ban hành Thường quy kỹ thuật định lượng trực khuẩn mủ xanh-Pseudomonas aeruginosa-trong thực phẩm (Văn bản hết hiệu lực)

QUYẾT ĐỊNH

VỀ VIỆC BAN HÀNH "THƯỜNG QUY KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH - PSEUDOMONAS AERUGINOSA - TRONG THỰC PHẨM"

BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ

Căn cứ theo Nghị định số 68/CP ngày 11/10/1993 của Chính phủ quy định chức năng,  nhiệm vụ, quyền hạn và  tổ chức bộ máy của Bộ Y tế;
Căn cứ theo Nghị định số 86/CP ngày 08/12/1995 của Chính phủ về việc phân công trách nhiệm quản lý nhà nước đối với chất lượng hàng hóa;
Căn cứ theo Quyết định số 14/1999/QĐ-TTg ngày 04/02/1999 của Thủ tướng Chính phủ về việc thành lập Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm;
Theo đề nghị của Chánh văn phòng, Vụ trưởng Vụ Khoa học Đào tạo, Vụ trưởng Vụ Pháp chế, Chánh thanh tra - Bộ Y tế và Cục trưởng Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm,

QUYẾT ĐỊNH

Điều 1. Ban hành kèm theo Quyết định này “Thường quy kỹ thuật định lượng trực khuẩn mủ xanh - Pseudomonas aeruginosa - trong thực phẩm”.

Điều 2. Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày ký ban hành.

Điều 3. Các Ông, Bà: Chánh văn phòng, Chánh thanh tra, Vụ trưởng các Vụ: Khoa học Đào tạo, Pháp chế, Y tế dự phòng- Bộ Y tế; Cục trưởng Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, Giám đốc Sở Y tế các Tỉnh,Thành phố trực thuộc Trung ương và Thủ trưởng các đơn vị trực thuộc Bộ Y tế chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này./.

THƯỜNG QUY KỸ THUẬT

ĐỊNH LƯỢNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH (PSEUDOMONAS AERUGINOSA) TRONG THỰC PHẨM

(Ban hành kèm theo Quyết định số 3347/ QĐ-BYT ngày 31 tháng 7 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế)

I. NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP

Sử dụng phương pháp  cấy đếm Pseudomonas aeruginosa trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt, sau khi ủ ấm ở nhiệt độ 42⁰C trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ xác định Pseudomonas aeruginosa bằng các thử nghiệm sinh vật hóa học theo thường quy.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Phát hiện các ô nhiễm do Pseudomonas aeruginosa trong sản phẩm thực phẩm hoặc thực phẩm đã được chế biến sẵn.

III. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ

1. Dụng cụ, thiết bị

Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật.

2. Môi trường, thuốc thử

- Thạch Pseudomonas (Pseudomonas agar)

- Thạch dinh dưỡng (Nutrient agar)

- Canh thang BHI (Brain Heart Infusion)

- Nước muối đệm pepton 9‰ (Buffer Pepton Water  - BPW)

- Môi trường sinh vật hoá học: Kligler (KIA); Lysin decarboxylaza (LDC), Citrat Simmon, Ure-indol

- Thuốc thử oxidaza, Kowac.

- Bộ thuốc nhuộm Gram.

IV. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ

1. Chuẩn bị môi trường

Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110^oC/30 phút hoặc 121^oC/15 phút).

2. Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử

2.1. Chuẩn bị mẫu

Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.

2.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10^-1

Cân chính xác 25g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 25ml thực phẩm lỏng), cho  vào bình nón chứa sẵn  225 ml nước muối đệm pepton (BPW) 9‰. Lắc đều 2 - 3 phút, thu được dung dịch mẫu thử 10^-1.

2.3. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10^-2,10^-3,10^-4....

- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10^-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối đệm pepton 9‰. Lắc đều trong 2-3phút, thu được dung dịch10^-2.

- Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10^-3, 10^-4, 10^-5.... (theo sơ đồ ).

3. Phương pháp tiến hành

Bước 1:

- Đánh dấu lên đĩa thạch nồng độ dung dịch mẫu thử .

- Dùng pipet 1ml vô trùng, hút chính xác 0,1 ml từ dung dịch thử 10^-1, nhỏ lên bề mặt đĩa thạch Pseudomonas đã đánh dấu nồng độ dung dịch mẫu thử tương ứng.

- Dùng que cấy kim loại hoặc que cấy thủy tinh ria đều để dung dịch mẫu được phân bố khắp mặt thạch sao cho các khuẩn lạc mọc phân tán đều.

- Ủ 42⁰C/ 24 giờ. Đọc kết quả.

Lưu ý: Thạch nuôi cấy phải được hong khô trước khi dùng. Mỗi mẫu thực phẩm phải được nuôi cấy ít nhất trong 3 đậm độ pha loãng. Mỗi đậm độ  pha loãng phải được cấy lên 2 đĩa thạch để tính trung bình cộng của mỗi đậm độ.

Bước 2: Đọc kết quả:    

- Đọc kết quả sau 24 giờ: đếm toàn bộ các khuẩn lạc có các đặc tính: tròn đều, mặt nhẵn, có sinh sắc tố màu xanh (nõn chuối, xanh lá mạ, xanh lục), có mùi thơm đặc trưng. Đánh dấu các khuẩn lạc nghi ngờ. ủ tiếp 24 giờ/ 42⁰C.

- Đọc kết quả sau 48 giờ: Đếm các khuẩn lạc nghi ngờ xuất hiện thêm (chủ yếu là các khuẩn lạc có sắc tố xanh).

Tính kết quả theo công thức:

Trong đó :

S C: Tổng số khuẩn lạc  đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại ở hai nồng độ pha loãng liên tiếp, ít nhất có một đĩa chứa trên 15 khuẩn lạc.

V: Thể tích mẫu cấy trên môi trường đĩa

n1 : Số đĩa được giữ lại ứng với độ pha loãng ban đầu

n₂: Số đĩa được giữ lại ứng với độ pha loãng thứ 2

d: Hệ số pha loãng thứ nhất được giữ lại để tính kết quả

Ví dụ :   Nồng độ 10^-2 có 168 khuẩn lạc (đĩa 1) và 215 khuẩn lạc (đĩa 2)

            Nồng độ 10^-3 có 14 khuẩn lạc (đĩa 1) và 25 khuẩn lạc (đĩa 2)

Như vậy, có 19.10⁴ vi khuẩn trong 1g mẫu thử

* Ghi chú:

- Chỉ đếm các đĩa thạch có số khuẩn lạc không vượt quá 300 để tính kết quả.

- Nếu các khuẩn lạc phân bố trên đĩa nuôi cấy không rõ ràng thì phải làm lại.

Bước 3: Xác định hình thể và tính chất bắt mầu

- Lấy khuẩn lạc nghi ngờ nhuộm Gram: Trực khuẩn hình gậy kích thước 2 - 3m, không bắt mầu thuốc nhuộm Gram,  Gr (-)

- Thử test Oxidaza

Bước 4: Tăng sinh thuần chủng và xác định tính chất sinh vật hoá học

4.1. Tăng sinh thuần chủng

- Trích biệt khuẩn lạc nghi ngờ cho vào ống canh thang BHI.

- Ủ ấm 37⁰C/ 24 giờ. Thu được canh trùng thuần nhất.

4.2. Thử tính chất sinh vật hoá học

Lấy canh trùng thuần nhất để thử các tính chất sinh vật hóa học:

- Lên men đường glucoza

- Lên men đường lactoza, sinh hơi, sinh H₂S.

- Sử dụng carbon trong môi trường citrat simom

- Khả năng sinh Indol

- Khả năng sinh men decarboxylaza.

Nếu cần: Ngưng kết với kháng huyết thanh đa giá để chẩn đoán quyết định trực khuẩn mủ xanh lần lượt từ serotyp P1 đến P16.

Tiêu chuẩn xác định trực khuẩn mủ xanh

- Trực khuẩn Gr             (-)         Oxidaza                        (+)        Khuẩn lạc có mầu xanh

- Glucoza                      (+)        Lactoza                         (-)

- Hơi                             (-)         H₂S                               (-)         Citrat simom       (-)

- Indol                           (-)         LDC                              (-)

Sơ đồ định lượng P. aeruginosa

1. Đồng nhất mẫu

Thạch Pseudomonas

3. Ủ ấm

Úp ngược đĩa thạch, để trong tủ ấm. Để 42⁰C/ 20 - 24 giờ.

4. Chọn đĩa thạch: Chọn đĩa có < 300 khuẩn lạc để đếm.

5. Tăng sinh thuần nhất

6. Xác định tính chất sinh vật hóa học

Glucoza:            (+)       Lactoza:            (-)                Hơi:           (-)       H₂S:                    (-)

Citrat simom:      (-)        Indol:                (-)                LDC:          (-)       Oxidaza:                         (+)